Po perfuzji krioprotekcyjnej pacjent nie trafia po prostu do ciekłego azotu.
Pacjenta poddaje się kontrolowanemu komputerowo programowi temperaturowemu trwającemu kilka dni. Czujniki umieszczone wewnątrz jego ciała pokazują, czy poszczególne okolice anatomiczne schładzają się równomiernie, czy rozjeżdżają się w niebezpieczne gradienty termiczne.
W trakcie schładzania zmienia się sam problem inżynieryjny. Na początku chłodzenie ma ograniczać powstawanie lodu. W okolicy przejścia w stan szklisty i poniżej niej ważniejsza od szybkości staje się precyzja i równomierność temperatury.
Dlaczego chłodzenie musi być kontrolowane
Krioprotektanty zmniejszają szybkość chłodzenia potrzebną do uniknięcia powstawania lodu. Dzięki nim tkanka bogata w wodę przechodzi w wysoce lepki, szklisty stan, zamiast krystalizować się w dużej skali.
Istotna temperatura przejścia w stan szklisty, oznaczana jako Tg, zależy od roztworu, jego koncentracji i metody pomiaru. Jest to pewien przedział, nie jeden uniwersalny próg biologiczny.
W przypadku roztworów stosowanych w krioprezerwacji ludzi ten przedział znajduje się zwykle w okolicy od -120°C do -135°C.
Powyżej tego przedziału zbyt wolne chłodzenie może dopuścić do zarodkowania i wzrostu kryształów lodu. Poniżej niego materiał zachowuje się coraz bardziej jak kruche ciało stałe.
Jeśli powierzchnia ciała schładza się znacznie szybciej niż jego wnętrze, różne okolice kurczą się w różnym stopniu. Powstałe w ten sposób naprężenia termomechaniczne mogą prowadzić do pęknięć.
Powstaje w ten sposób wąska ścieżka postępowania: schłodzić na tyle szybko, by doszło do witryfikacji, a następnie, gdy pacjent przechodzi w stan szklisty, kontrolować gradienty i tempo chłodzenia.
Zagadnienie przejść fazowych opisuje artykuł o różnicy między zamrażaniem a witryfikacją.
Pierwsza generacja komory chłodzącej
Pierwsza generacja systemu Tomorrow.bio, nazywana komorą chłodzącą V1, ustaliła podstawową architekturę kontrolowanego schładzania całego ciała.
Pacjenta umieszcza się w dedykowanej, izolowanej komorze. Komputer kontroluje panujące w niej warunki kriogeniczne, a termopary mierzą temperaturę w wielu punktach.
Kontroler realizuje zaprogramowaną krzywą chłodzenia, a nie stałe maksymalne wychłodzenie. Każdy kanał czujnika jest zapisywany jako część historii termicznej pacjenta.
To już zasadnicza różnica względem bezpośredniego zanurzenia. Maszyna może zwolnić, zatrzymać lub zmienić warunki w komorze w odpowiedzi na to, co faktycznie dzieje się z pacjentem.
Druga generacja systemu opartego na dewarze
Druga generacja rozwiązania Tomorrow.bio przenosi kontrolowane schładzanie do specjalnie zbudowanego dewara.
Pacjent pozostaje wewnątrz dewara, a wyspecjalizowana pokrywa integruje osprzęt chłodzący, elementy sterowania komputerowego, zawory, złącza czujników i przepusty termopar.
Termopary umieszczone są w kilku punktach wewnątrz ciała pacjenta. Dodatkowe czujniki monitorują warunki termiczne wewnątrz samego dewara.
System widzi więc więcej niż zadaną wartość docelową. Widzi, jak szybko reagują poszczególne, mierzone okolice ciała pacjenta.
Komputer dostosowuje gradient temperatury w dewarze i tempo schładzania tak, by odczyty pozostawały w granicach dopuszczonych przez protokół.
Duże ciało nie może w trakcie chłodzenia mieć w każdym punkcie tej samej temperatury. Praktycznym celem jest ograniczenie rozrzutu temperatur i niedopuszczenie, by którakolwiek mierzona okolica wyprzedzała pozostałe albo za nimi zostawała w niebezpiecznym stopniu.
Geometria dewara ogranicza również liczbę czynności między kontrolowanym schładzaniem a przechowywaniem kriogenicznym. Ta sama zamknięta forma zapewnia stabilne, symetryczne warunki wokół pacjenta.
Temperatura zadana nie jest temperaturą pacjenta
Kontroler może szybko wychłodzić otoczenie. Nie może natychmiast doprowadzić wnętrza ludzkiego ciała do tej samej temperatury.
Ciepło musi przejść z głębszych tkanek w kierunku powierzchni. Na obserwowane opóźnienie wpływają geometria ciała, jego skład, rozkład krioprotektantów i położenie czujników.
Dlatego jeden czujnik w komorze nie wystarcza. Nominalna temperatura otoczenia równa -130°C nie dowodzi, że każda mierzona okolica ciała pacjenta rzeczywiście osiągnęła -130°C.
System kontrolny musi brać pod uwagę zarówno temperaturę absolutną, jak i różnice między kanałami. Punkt najwolniejszy, punkt najszybszy oraz ogólny rozrzut wartości niosą każdorazowo istotną informację.
Znaczenie ma również kalibracja termopar, ich rozmieszczenie i ciągłość odczytu. Odczyty nieprawdopodobne albo awarie czujników powinny zostać oznaczone, a nie po cichu wliczone w uśrednioną krzywą.
Trzyetapowy program temperaturowy Tomorrow.bio
Obecny protokół obejmuje trzy odrębne fazy. Podane wartości są celami operacyjnymi dla tego konkretnego sprzętu i tej metody krioprotekcji, nie uniwersalnymi stałymi dla każdego systemu witryfikacji.
1. Szybkie schłodzenie w kierunku -130°C
Pierwsza faza przenosi pacjenta z temperatury suchego lodu w kierunku około -130°C tak szybko, jak bezpiecznie pozwala na to zmierzony rozrzut temperatur.
Szybkość ma tu znaczenie, ponieważ w niedostatecznie zabezpieczonych okolicach może dojść do powstania lodu, zanim tkanka przejdzie w stan szklisty.
Komputer nie kieruje się jedynie upływem czasu. Monitoruje odczyty termopar i dostosowuje do nich warunki chłodzenia wokół pacjenta.
2. Kontrolowany wzrost temperatury w kierunku -120°C
Po osiągnięciu około -130°C aktywne chłodzenie zostaje ograniczone, a temperatura pacjenta wzrasta naturalnie w kierunku około -120°C.
To faza wygrzewania odprężającego. W okolicy Tg materiał krioprotekcyjny zachowuje jeszcze wystarczającą ruchliwość molekularną, by część zgromadzonych naprężeń mechanicznych mogła się rozładować.
Ten wzrost temperatury daje też cieplejszym i chłodniejszym okolicom czas na wyrównanie różnic, zanim materiał zostanie poprowadzony głębiej w sztywny stan szklisty.
Wygrzewanie nie odwraca wcześniej powstałych uszkodzeń biologicznych. Jego cel jest węższy: ograniczenie gradientów termicznych i naprężeń wynikających z nierównomiernego skurczu.
3. Spadek do -196°C w tempie około 1°C na godzinę
Od około -120°C docelowe tempo spadku wynosi około 1°C na godzinę, aż pacjent osiągnie temperaturę ciekłego azotu.
Ten ostatni odcinek 76 stopni trwa około trzech dni, nawet bez uwzględnienia przerw i korekt kontrolnych.
Utrzymanie tempa 1°C na godzinę w dużym, termicznie niejednolitym ciele jest problemem kontroli, a nie jedynie ustawieniem stopera.
Kontroler musi na bieżąco dostosowywać warunki w dewarze tak, by wewnętrzne termopary schładzały się równocześnie, bez powstawania nadmiernych gradientów.
Kiedy jedna okolica pozostaje w tyle, wymuszenie niższej temperatury otoczenia może przechłodzić inną. Precyzja oznacza równoważenie odczytów z całego zestawu czujników, nie pogoń za jednym z nich.
Dlaczego faza wygrzewania jest naukowo uzasadniona
Badania nad witryfikacją w dużej skali wskazują dwie konkurujące ze sobą strefy zagrożenia: niewystarczające chłodzenie powyżej Tg oraz nadmierne naprężenia mechaniczne w okolicy Tg i poniżej niej.
Badanie z 2024 roku dotyczące witryfikacji w skali ludzkiego narządu wykorzystało wiele wewnętrznych sond i wykazało, że wygrzewanie zmniejsza gradienty, zanim materiał przejdzie w fazę szklistą.
To samo badanie wykazało, że wolne chłodzenie poniżej strefy wygrzewania pomaga uniknąć odbudowy dużych gradientów i naprężeń.
Osobne badania termomechaniczne wykazały, że wygrzewanie w okolicy Tg istotnie zmienia naprężenia resztkowe i osłabia ich zależność od wcześniejszego tempa chłodzenia.
Te badania potwierdzają zasadność przyjętej strategii kontroli. Nie stanowią jednak niezależnej weryfikacji każdej konkretnej wartości zadanej w protokole Tomorrow.bio dla całego ciała.
Całe ludzkie ciała są większe i bardziej niejednorodne niż roztwory laboratoryjne czy pojedyncze narządy. Bezpośrednie zapisy temperatury i obrazowanie po schłodzeniu pozostają niezbędne.
Co zapisuje komputer
Przydatnym wynikiem nie jest komunikat mówiący, że schładzanie zostało zakończone. Jest nim pełny szereg czasowy danych z każdego kanału temperaturowego.
Zapis powinien pokazywać tempo zmian, przerwy, wzrosty temperatury, gradienty między czujnikami, działania kontrolera, alarmy oraz każde odstępstwo od zaplanowanej krzywej.
Te dane stają się częścią oceny jakości krioprezerwacji.
Po schłodzeniu standaryzowane badanie CT wykonane w temperaturze ciekłego azotu może wykryć rozkład krioprotektantów, lód, wyraźne deformacje i pęknięcia, których same dane temperaturowe nie ujawniają.
Dlaczego proces kończy się w temperaturze ciekłego azotu
Przy normalnym ciśnieniu atmosferycznym azot wrze w temperaturze około 77,34 kelwina, czyli około -195,8°C, zgodnie z danymi NIST Chemistry WebBook.
Przechowywanie w ciekłym azocie jest procesem pasywnym. Dopóki w naczyniu pozostaje wystarczająca ilość cieczy, jej równowaga wrzenia utrzymuje stabilne warunki kriogeniczne bez chłodzenia mechanicznego.
Kontrolowane schładzanie zakończy się dopiero wtedy, gdy pacjent jest termicznie przygotowany do tego stabilnego stanu. Przechowywanie nie zastępuje etapu schładzania.
Konstrukcję i kompromisy techniczne kolejnego etapu opisuje artykuł o nowoczesnych dewarach kriogenicznych i przechowywaniu w temperaturach pośrednich.
W skrócie: Tomorrow.bio stosuje chłodzenie kontrolowane komputerowo oraz wewnętrzne czujniki temperatury. Proces szybko schładza ciało w pobliżu przejścia w stan szklisty, odpręża naprężenia termiczne, a następnie prowadzi je powoli w kierunku -196°C.
Narzędzie praktyczne w szczegółach
Interaktywne narzędzie pomaga zbadać pytanie poruszone w tym artykule.
Wczytywanie narzędzia interaktywnego...
Więcej informacji