Witryfikacja nie jest efektem jednego wynalazku. Powstała stopniowo, w miarę jak badacze rozwiązywali kolejne, różne problemy dotyczące komórek, zarodków, narządów i wreszcie ludzkiej biostazy.
Cel wydaje się prosty: schłodzić tkankę bogatą w wodę tak, aby przeszła w stan szklisty bez wytworzenia szkodliwych kryształów lodu.
W praktyce jest to znacznie trudniejsze. Krioprotektanty mogą być toksyczne. Ich wprowadzanie może zniekształcać komórki. Duże obiekty chłodzą się nierównomiernie, kumulują naprężenia i znacznie trudniej je ponownie ogrzać.
Współczesne procedury są złożonymi systemami, a nie prostymi recepturami. Ich jakość zależy od współdziałania chemii, perfuzji, temperatury, czasu, geometrii i pomiaru.
Przed witryfikacją: zimno powodowało dodatkowe uszkodzenia
Wczesne metody krioprezerwacji polegały w gruncie rzeczy na zamrażaniu. Chłodzenie spowalniało reakcje chemiczne, lecz woda zamarzała, tworząc kryształy lodu.
Lód wypycha sole i inne substancje rozpuszczone do pozostałej cieczy. Komórki mogą więc jednocześnie ulegać uszkodzeniom mechanicznym, działaniu skrajnie wysokich stężeń substancji rozpuszczonych, odwodnieniu i uszkodzeniom błon.
Szybsze chłodzenie może ograniczyć rozmiar kryształów, ale aby czysta woda przeszła w stan szklisty bez dodatków chemicznych, potrzebne jest niezwykle wysokie tempo chłodzenia. Działa to tylko w przypadku bardzo tonkich próbek.
Historyczny problem nie polegał jedynie na osiągnięciu niskiej temperatury. Chodziło o osiągnięcie niskiej temperatury bez dopuszczenia do uformowania się szkodliwych kryształów lodu.
1937 do 1938: pierwsze doświadczenia z witryfikacją kinetyczną
Basile Luyet zaproponował witryfikację jako strategię konserwacji biologicznej w 1937 roku.
W 1938 roku Luyet i Eugene Hodapp opisali odzyskanie ruchliwości przez plemniki żaby po ekspozycji na ciekłe powietrze i wcześniejszym odwodnieniu skoncentrowanym roztworem sacharozy.
Pierwotny eksperyment był możliwy dzięki mikroskopijnej grubości próbek i ekstremalnie szybkiemu chłodzeniu. Pokazał fizyczną możliwość witryfikacji, ale nie dostarczył skalowalnego protokołu dla narządów.
Podejście to określa się dziś jako witryfikację kinetyczną: chodzi o wyprzedzenie krystalizacji przez odbieranie ciepła szybciej, niż lód może zacząć się tworzyć i rosnąć.
Podejście to przestaje działać wraz ze wzrostem skali. Wraz ze wzrostem objętości stosunek powierzchni do objętości maleje, dlatego środek dużej próbki chłodzi się znacznie wolniej niż jej powierzchnia.
1949: glicerol zmienia problem
Christopher Polge, Audrey Smith i Alan Parkes odkryli w 1949 roku, że glicerol może chronić plemniki podczas przechowywania w niskiej temperaturze.
Ich raport w Nature wykazał praktyczne znaczenie penetrujących krioprotektantów.
Cząsteczki tych substancji wnikają do komórek, oddziałują z wodą i ograniczają ilość lodu powstającego w danej temperaturze. Zmniejszają też szkodliwe stężenie substancji rozpuszczonych podczas zamrażania.
Odkrycie to zmieniło kriobiologię, ponieważ szybkość chłodzenia przestała być jedynym parametrem, który można było kontrolować. Skład chemiczny mógł zmieniać zachowanie fazowe wody.
Jednocześnie pojawił się nowy problem optymalizacji. Więcej krioprotektanta skuteczniej powstrzymuje lód, ale zwiększa uszkodzenia chemiczne i osmotyczne.
1959 do 1968: nowe substancje i stopniowe zwiększanie stężenia
W 1959 roku James Lovelock i Marcus Bishop wykazali, że dimetylosulfoksyd chroni różne typy komórek przed uszkodzeniami wywołanymi zamrażaniem.
DMSO łatwiej niż glicerol przenikał przez niektóre błony komórkowe. Rozszerzył zakres komórek, które można było chronić krioprotekcyjnie, i do dziś jest szeroko stosowany w krioprezerwacji laboratoryjnej i klinicznej.
John Farrant badał następnie stopniowe zwiększanie stężenia krioprotektanta przy równoczesnym obniżaniu temperatury, tak aby tkanka pozostawała w stężonym roztworze bez celowego wywoływania zamarzania.
Zapowiadało to kluczową cechę współczesnych protokołów: krioprotektant wprowadza się etapami i w niskiej temperaturze, zamiast od razu narażać ciepłą tkankę na jego pełne stężenie.
Stopniowe wprowadzanie ogranicza szok osmotyczny. Niższa temperatura spowalnia wiele reakcji chemicznych i może zwiększać tolerancję tkanki na ekspozycję, która w innych warunkach byłaby szkodliwa.
W 1968 roku eksperymenty wykazały, że krwinki czerwone mogą osiągnąć temperaturę ciekłego azotu bez widocznego lodu przy wystarczająco wysokim stężeniu glicerolu.
Podstawowe założenia tej metody były już znane. Brakowało praktycznego sposobu zastosowania ich do złożonej, ukrwionej tkanki.
1984: witryfikacja staje się strategią dla narządów
Praca z 1984 roku „Vitrification as an Approach to Cryopreservation” przedstawiła witryfikację jako poważną metodę rozwoju bankowania narządów.
Strategię tę określano czasem mianem witryfikacji równowagowej. Zamiast wymagać nieosiągalnie szybkiego chłodzenia, zakładała użycie takiej ilości krioprotektanta, aby krytyczne tempo chłodzenia było osiągalne również w większym układzie.
Ta zmiana odsłoniła trzy powiązane ograniczenia:
- Roztwór musi powstrzymywać lód przy osiągalnych szybkościach chłodzenia i ogrzewania.
- Narząd musi tolerować wprowadzanie i usuwanie tego roztworu.
- Krioprotektant musi dotrzeć do każdego obszaru, zanim zacznie się chłodzenie.
Roztwór mógł sprawdzać się w probówce, a zawodzić w narządzie, ponieważ o wyniku decydowały także opór naczyniowy, odległość dyfuzji i toksyczność.
1985: żywe zarodki wracają ze stanu szklistego
William Rall i Gregory Fahy opisali bezlodowe krioprezerwowanie zarodków myszy w temperaturze -196°C w 1985 roku.
Był to rozstrzygający dowód biologiczny. Komórki zarodkowe ssaków mogły przetrwać chłodzenie i ogrzewanie po przejściu przez całkowicie zwitryfikowany stan.
Zarodki są wciąż bardzo małe. Ich temperatura i stężenie mogą się zmieniać szybko i równomiernie w porównaniu z dorosłym narządem.
Wynik potwierdził skuteczność tej metody w małej skali, a zarazem uwidocznił problem skalowania.
Problem skali rozpada się na cztery problemy
1. Toksyczność krioprotektanta
Stężenie potrzebne do witryfikacji może zakłócać białka, błony i metabolizm komórkowy. Toksyczność zależy od substancji, stężenia, temperatury, czasu ekspozycji i typu tkanki.
Oznacza to, że określenie „mniej toksyczny” nie odnosi się wyłącznie do pojedynczej cząsteczki. Odnosi się do całego protokołu wprowadzania i usuwania substancji.
2. Stres osmotyczny
Dodanie skoncentrowanego roztworu wypycha wodę z komórek. Zbyt szybkie usunięcie tego roztworu może spowodować gwałtowny napływ wody do komórek.
Współczesne protokoły stosują stopniowe zwiększanie stężenia, roztwory nośnikowe, kontrolę temperatury i substancje niepenetrujące, by wahania objętości komórek nie przekraczały tolerowanych granic.
3. Nierównomierne dostarczanie
Narząd nie jest jednorodnym zbiornikiem wypełnionym cieczą. Krioprotektant przemieszcza się przez naczynia, przenika przez ściany naczyń włosowatych i dyfunduje w tkance.
Zakrzepy, obrzęk, choroby naczyniowe, niedokrwienie i bariera krew-mózg mogą sprawić, że część obszarów nie osiągnie stężenia potrzebnego do powstrzymania lodu.
To dlatego współczesna perfuzja mierzy ciśnienie, przepływ, temperaturę i stężenie żylne, a nie polega jedynie na objętości podanego roztworu.
4. Gradienty termiczne
Duży obiekt chłodzi się od zewnątrz do wewnątrz. Różne temperatury powodują różne tempo skurczu.
W pobliżu temperatury przejścia szklistego i poniżej niej materiał nie może szybko rozpraszać naprężeń. Gdy naprężenie przekroczy wytrzymałość mechaniczną, mogą powstać pęknięcia.
Rozwiązaniem stało się chłodzenie z kontrolowaną szybkością, wygrzewanie w pobliżu temperatury przejścia szklistego, Tg, oraz wolniejsze obniżanie temperatury w zakresie stanu szklistego. Te zasady kształtują dziś komputerowo kontrolowane chłodzenie ludzkiego ciała.
Lata 1990. i 2000.: mieszaniny zamiast pojedynczych substancji
Żaden pojedynczy krioprotektant nie spełniał wszystkich wymagań jednocześnie. Badacze coraz częściej łączyli penetrujące krioprotektanty, aby żadnego z nich nie trzeba było stosować w szczególnie toksycznym stężeniu.
Roztwory nośnikowe kontrolowały jony, pH i warunki osmotyczne. Polimery niepenetrujące wpływały na wodę tkankową i zachowanie naczyń.
Syntetyczne inhibitory lodu miały ograniczać heterogeniczne zarodkowanie i wzrost kryształów lodu. Ograniczały potrzebę samego zwiększania stężenia krioprotektanta.
Roztwory takie jak VS55, a później M22, ilustrowały podejście systemowe: łączyły wiele substancji, inhibitory lodu i starannie opracowany roztwór nośnikowy z określonymi protokołami perfuzji oraz kontroli temperatury.
Przegląd witryfikacji narządów z 2004 roku opisuje postępy w ograniczaniu toksyczności, uszkodzeniach chłodowych, kontroli nukleacji i perfuzji narządów.
Istotny postęp nie polegał na całkowitym wyeliminowaniu toksyczności. Badacze nauczyli się ograniczać jej skutki dzięki odpowiedniemu doborowi chemii, czasu ekspozycji i temperatury.
Eksperymenty z nerkami króliczymi: ważne i łatwe do przecenienia
Prace na nerkach króliczych wykazały, że ukrwiony narząd ssaka można nasycić złożonym roztworem witryfikacyjnym, schłodzić do stanu szklistego, ponownie ogrzać i przeszczepić.
Jedna z opisanych nerek przez dłuższy czas pełniła u królika funkcję jedynej czynnej nerki.
Ten wynik ma znaczenie, ponieważ przeniósł badania z próbek mikroskopowych na poziom funkcji narządu. Nie ustanowił jednak wiarygodnej procedury klinicznej.
Późniejsza literatura wskazuje, że długotrwałego sukcesu przeszczepowego nie udało się powtórzyć w sposób odtwarzalny. Dystrybucja, toksyczność i tradycyjne ogrzewanie powierzchniowe pozostawały czynnikami ograniczającymi.
Tak należy interpretować ten wynik: jako istotny dowód słuszności założenia, ograniczony problemami z odtwarzalnością i skalowaniem.
2015: jakość konserwacji staje się widoczna na poziomie synaps
Krioprezerwacja stabilizowana aldehydami łączyła utrwalanie chemiczne, perfuzję krioprotektantem i witryfikację mózgów królików oraz świń.
Badanie z 2015 roku wykazało wyraźne błony, synapsy, pęcherzyki, mielinę i struktury wewnątrzkomórkowe po ponownym ogrzaniu i przygotowaniu do mikroskopii elektronowej.
Wykazało, że doskonała ultrastruktura tkanki nerwowej może przetrwać cykl przechowywania bez lodu w dużych mózgach.
Nie wykazało jednak możliwości odzyskania żywotnej funkcji biologicznej. Fiksacja aldehydowa celowo tworzy wiązania krzyżowe w materiale biologicznym i jest niezgodna ze zwykłym przywróceniem żywej funkcji.
Eksperyment odpowiedział więc na pytanie o zachowanie struktury, a nie o możliwość przywrócenia funkcji życiowych.
Szersze znaczenie tego badania miało charakter metodologiczny: jakość konserwacji należy oceniać, badając struktury istotne dla danej funkcji, a nie tylko obserwując szklisty wygląd próbki.
2023: nanoogrzewanie pomaga rozwiązać problem ogrzewania nerek szczurzych
Chłodzenie jest tylko jednym z etapów odwracalnej krioprezerwacji. Ponowne ogrzewanie jest często trudniejsze.
Jeśli ogrzewanie jest zbyt wolne, lód może rosnąć w trakcie dewitryfikacji. Jeśli ciepło dociera głównie od powierzchni, gradienty termiczne mogą spowodować pęknięcie narządu.
Nanoogrzewanie może ograniczać oba te problemy: nanocząstki tlenku żelaza rozprowadza się w naczyniach krwionośnych, a następnie ogrzewa zmiennym polem magnetycznym o częstotliwości radiowej.
W 2023 roku badacze zwitryfikowali nerki szczurze, przechowywali je do 100 dni, ogrzali metodą nanoogrzewania i przeszczepili.
Odzyskane nerki zapewniały funkcję nerek podtrzymującą życie u biorców pozbawionych własnych nerek przez okres opisanej obserwacji.
Osiągnięcie to wynikało nie tylko z zastosowania ogrzewania. Zespół przeszedł na mniej toksyczną formułę i modelował wprowadzanie krioprotektanta, by poprawić jego stężenie w tkance.
Historia witryfikacji pokazuje, że rozwiązanie jednego wąskiego gardła ujawnia kolejne, a skuteczne odzyskanie funkcji wymaga sprawnego działania całego procesu.
2024 do 2026: większe układy fizyczne i funkcjonalna tkanka nerwowa
W 2024 roku badacze opisali fizyczną witryfikację układów o objętości od 0,5 do 3 litrów, czyli zbliżonej do objętości ludzkiego narządu.
Połączyli wewnętrzną termometrię, wygrzewanie, kontrolowane chłodzenie i badanie mikro-CT. Wykazali też nanoogrzewanie w objętościach do 2 litrów.
Największe doświadczenia dotyczyły przede wszystkim fizycznych aspektów procesu. Brak widocznego lodu i pęknięć jest warunkiem koniecznym, ale nie dowodzi możliwości biologicznego odzyskania funkcji narządu wielkości ludzkiego.
W 2026 roku badanie w PNAS opisało krótkotrwałe odzyskanie funkcji tkanki hipokampa dorosłej myszy po witryfikacji i ponownym ogrzaniu.
Badanie mierzyło morfologię, reaktywność mitochondrialną, pobudliwość neuronalną, transmisję synaptyczną i długotrwałe wzmocnienie synaptyczne.
Badanie dotyczyło skrawków mózgu myszy oraz niskoprzepustowych preparatów całego mózgu myszy, a nie mózgu ludzkiego. Znaczenie tego wyniku jest ograniczone, choć nadal istotne.
Wykazało, że dorosła tkanka nerwowa ssaka może odzyskać funkcje elektrofizjologiczne po przejściu w stan szklisty, w którym mobilność molekularna praktycznie ustaje.
Ludzka biostaza wykorzystuje te doświadczenia w znacznie trudniejszych warunkach
W badaniach nad bankowaniem narządów wykorzystuje się zdrową tkankę, a czas procedury i dostęp do naczyń krwionośnych są kontrolowane z wyprzedzeniem.
Ludzka biostaza zaczyna się po śmierci prawnej. Choroba, ciepłe niedokrwienie, zakrzepy, obrzęk, transport i choroby naczyniowe mogą zakłócić dostarczanie krioprotektanta.
Bezpośrednim celem jest zachowanie struktury z myślą o możliwej przyszłej naprawie, a nie uzyskanie już teraz odwracalnego przeszczepu.
Z tego powodu wyników laboratoryjnych nie można bezpośrednio przekładać na wnioski dotyczące pacjentów.
Jak Tomorrow.bio dostosował witryfikację do warunków terenowych
Tomorrow.bio umożliwił prowadzenie perfuzji krioprotekcyjnej całego ciała w wyspecjalizowanych ambulansach. Procedura może zacząć się w pobliżu pacjenta, bez czekania na transport do Szwajcarii.
Pozwala to ograniczyć istotny problem, którego sama chemia nie może rozwiązać: czas niedokrwienia przed perfuzją.
Obecny protokół wykorzystuje chemię roztworu na bazie VM-1, przystosowaną do krioprotekcji polowej i późniejszego transportu na suchym lodzie.
Program badawczy EBF badał VM-1 w symulowanych warunkach pośmiertnych, w tym po trzech godzinach ciepłego niedokrwienia.
W programie mierzono współczynnik załamania światła w odpływie żylnym, czas perfuzji, zmianę masy, skurcz mózgu i tworzenie lodu, a równocześnie testowano zmiany składu perfuzatu oraz procedury.
W przypadku ludzi kluczowe pytanie brzmi nie, czy idealny roztwór może ulec witryfikacji, lecz jak skutecznie można przeprowadzić perfuzję u rzeczywistego pacjenta po niedokrwieniu.
Pomiar stał się częścią procedury
Wczesne badania nad witryfikacją potwierdzały sukces zwykle przez przezroczystość, kalorymetrię, dyfrakcję rentgenowską, przeżycie lub funkcję po ponownym ogrzaniu.
W przypadku ludzkiej biostazy odzyskanie funkcji nie może dziś służyć jako punkt odniesienia. Dlatego potrzebne są zarówno niedestrukcyjne metody oceny, jak i analiza pobranych próbek.
Tomorrow.bio wykonuje tomografię komputerową każdego pacjenta w temperaturze ciekłego azotu, aby w standaryzowanych warunkach oszacować rozkład krioprotektanta oraz wykryć lód i defekty makroskopowe.
Za odrębną zgodą można pobrać mikroskopijne próbki tkanki nerwowej do oceny błon, synaps i lokalnej ultrastruktury w mikroskopii elektronowej.
Te metody i ich ograniczenia opisano w procedurach kontroli jakości biostazy.
Pomiar zmienia sam rozwój tej dziedziny. Gdy niepowodzenie można wykryć i porównać między przypadkami, zmiany w chemii i protokole można projektować tak, aby ograniczać jego przyczyny.
Co się poprawiło, a co wciąż nie zostało rozwiązane
Współczesna witryfikacja umożliwiła osiągnięcia, które były niedostępne dla wczesnych metod zamrażania:
- Bezlodową konserwację wielu komórek, zarodków i małych tkanek.
- Odzyskanie funkcji zwitryfikowanych narządów zwierzęcych w określonych eksperymentach.
- Zachowanie struktury na poziomie synaps w utrwalonych mózgach ssaków.
- Komputerowo kontrolowane chłodzenie i wygrzewanie większych systemów.
- Ogrzewanie objętościowe za pomocą technologii, takich jak nanoogrzewanie.
- Metody tomografii komputerowej i mikroskopii elektronowej do pomiaru rzeczywistych wyników konserwacji.
Nie umożliwiła jednak odwracalnej krioprezerwacji całego ludzkiego ciała.
Nierozwiązane problemy obejmują niedokrwienie pośmiertne, nierównomierną perfuzję, toksyczność krioprotektantów, barierę krew-mózg, gradienty temperatury w całym ciele, zapobieganie pęknięciom oraz bezpieczne i równomierne ogrzewanie.
Nawet skuteczne zachowanie struktury pozostawiłoby do rozwiązania problemy przyszłej naprawy, przywrócenia funkcji życiowych i leczenia pierwotnej przyczyny śmierci.
Te rozróżnienia opisano w wyzwaniach technicznych odwracalnej krioprezerwacji.
W skrócie: Rozwój witryfikacji wynika z lepszych krioprotektantów, perfuzji, kontroli tworzenia lodu, chłodzenia, ogrzewania i oceny struktury. Niektóre problemy rozwiązano w małej skali, natomiast odwracalna krioprezerwacja całego człowieka pozostaje poza zasięgiem obecnych metod.
Narzędzie praktyczne w szczegółach
Interaktywne narzędzie pomaga zbadać pytanie poruszone w tym artykule.
Wczytywanie narzędzia interaktywnego...
Więcej o tym temacie