Witryfikacja nie była jednym wynalazkiem. Powstała, gdy badacze rozwiązywali kolejne problemy dotyczące komórek, zarodków, narządów, a w końcu ludzkiej biostazji.
Cel brzmi prosto: schłodzić tkankę bogatą w wodę do stanu szklistego, bez tworzenia się szkodliwego lodu.
Realizacja nie jest prosta. Krioochronne substancje mogą być toksyczne. Ich wprowadzanie może zniekształcać komórki. Duże obiekty ochładzają się nierównomiernie, gromadzą naprężenia i są znacznie trudniejsze do ponownego ogrzania.
Nowoczesne procedury są zatem systemami, a nie przepisami. Ich jakość zależy od współpracy chemii, perfuzji, temperatury, czasu, geometrii i pomiarów.
Przed witryfikacją: zimno powodowało drugie uszkodzenie
Wczesna krioprezerwacja oznaczała głównie zamrażanie. Ochłodzenie spowalniało reakcje chemiczne, lecz woda krystalizowała się w lód.
Lód wypiera sole i inne substancje rozpuszczone do pozostałej cieczy. Komórki mogą zatem doświadczać jednocześnie przemieszczenia mechanicznego, ekstremalnych stężeń substancji, odwodnienia i uszkodzenia błon.
Szybsze ochładzanie może prowadzić do powstawania mniejszych kryształów, lecz zwykła woda wymaga wyjątkowo wysokich szybkości, aby stać się szkłem bez pomocy chemicznej. Działa to jedynie w przypadku bardzo cienkich próbek.
Historycznym problemem nie było jedynie osiągnięcie niskiej temperatury. Było nim osiągnięcie jej bez pozwolenia wodzie na reorganizację w szkodliwe kryształy.
1937 do 1938: pierwsze eksperymenty kinetycznej witryfikacji
Basile Luyet zaproponował witryfikację jako strategię zachowania biologicznego w 1937.
W 1938 Luyet i Eugene Hodapp zgłosili odzyskanie ruchliwości w spermie żab po wystawieniu na działanie powietrza płynnego, po odwodnieniu przy użyciu stężonego sacharozy.
Eksperymentoryginalny opierał się na mikroskopijnych warstwach i ekstremalnej szybkości ochładzania. Dowiódł fizycznej możliwości, a nie skalowalnego protokołu dla narządów.
To podejście nazywa się obecnie kinetyczną witryfikacją: wyprzedzić krystalizację poprzez usuwanie ciepła szybciej, niż lód może się zarodkować i rosnąć.
Skala go pokonuje. Powierzchnia rośnie wolniej niż objętość, więc środek dużej próbki nie nadąża za powierzchnią.
1949: glicerol zmienia problem
Christopher Polge, Audrey Smith i Alan Parkes odkryli w 1949, że glicerol może chronić plemniki podczas niskotemperaturowej konserwacji.
Szanowny Panie, szanowna Pani,raport Natureustanowił praktyczne znaczenie penetrujących środków krioprotekcyjnych.
Cząsteczki te wnikają do komórek, wiążą wodę i zmniejszają ilość lodu tworzącego się w danej temperaturze. Zmniejszają także szkodliwe stężenie substancji rozpuszczonych podczas zamrażania.
Odkrycie zrewolucjonizowało kriobiologię, ponieważ szybkość chłodzenia przestała być jedyną zmienną kontrolną. Skład chemiczny mógł kształtować zachowanie fazowe wody.
Wprowadziło to także nowy problem optymalizacyjny. Większa ilość krioprotektantu skuteczniej hamuje tworzenie się lodu, ale zwiększa uszkodzenia chemiczne i osmotyczne.
1959 do 1968: więcej środków i stopniowe wprowadzanie
W 1959 James Lovelock i Marcus Bishop donieśli, że dimetylosulfotlenek chronił kilka typów komórek przed uszkodzeniem mrożeniowym.
DMSO przenikał przez niektóre błony łatwiej niż glicerol. Poszerzył zakres komórek, które można było zabezpieczyć krioprotekcyjnie, i pozostaje szeroko stosowany w laboratoryjnej oraz klinicznej kriokonserwacji.
John Farrant zbadał następnie podnoszenie stężenia krioprotektantu przy jednoczesnym obniżaniu temperatury, utrzymując tkankę w skoncentrowanej cieczy bez celowego tworzenia lodu.
To przewidziało kluczową cechę nowoczesnych protokołów: wprowadzanie krioprotektantu stopniowo, w niskiej temperaturze, zamiast narażania ciepłej tkanki na pełne stężenie od razu.
Stopniowe wprowadzanie ogranicza wstrząs osmotyczny. Niższa temperatura spowalnia wiele reakcji chemicznych i może uczynić w przeciwnym razie szkodliwe narażenie bardziej znośnym.
W 1968 eksperymenty wykazały, że erytrocyty mogą osiągnąć temperaturę ciekłego azotu bez widocznego lodu przy wystarczająco wysokim stężeniu glicerolu.
Wszystkie koncepcyjne elementy były obecne. Brakującym ogniwem pozostawała praktyczna metoda zastosowania ich do złożonej, unaczynionej tkanki.
1984: witryfikacja staje się strategią dla narządów
Praca opublikowana w 1984„Witryfikacja jako podejście do kriokonserwacji”przedefiniowała witryfikację jako poważną drogę do bankowania narządów.
Strategia była czasem nazywana witryfikacją równowagową. Zamiast wymagać niemożliwej do osiągnięcia szybkości chłodzenia, stosuje się wystarczającą ilość krioprotektantu, aby krytyczna szybkość chłodzenia była osiągalna w większym systemie.
To przesunięcie ujawniło trzy powiązane ze sobą ograniczenia:
- Rozwiązanie musi wytrzymać lód przy osiągalnych tempie chłodzenia i ogrzewania.
- Narząd musi tolerować obciążanie i odciążanie tym roztworem.
- Krioprotektant musi dotrzeć do każdego regionu przed rozpoczęciem chłodzenia.
Formulacja mogłaby doskonale sprawdzać się w probówce, a zawieść w narządzie, ponieważ opór naczyniowy, odległość dyfuzji lub toksyczność zmieniły wynik.
1985: żywe embriony powracają ze stanu szklistego
William Rall i Gregory Fahy donosili okrioprezerwacji bez lodu mysich embrionów w -196°C w 1985.
Był to decydujący dowód biologiczny. Żywe komórki ssaków z jądrami mogły przetrwać chłodzenie i ponowne ogrzanie w całkowicie zeszklonym stanie.
Embriony są nadal niewielkie. Ich temperatura i stężenie mogą zmieniać się szybko i równomiernie w porównaniu z dorosłym narządem.
Wynik potwierdził metodę, jednocześnie uwidaczniając problem skali.
Problem skali dzieli się na cztery problemy
1. Toksyczność krioprotektantu
Stężenie potrzebne do witryfikacji może zakłócać białka, błony i metabolizm komórkowy. Toksyczność zależy od czynnika, stężenia, temperatury, czasu ekspozycji i rodzaju tkanki.
Oznacza to, że „mniej toksyczny” nie jest właściwością pojedynczej cząsteczki. Jest to właściwość kompletnego protokołu obciążania i odciążania.
2. Stres osmotyczny
Dodanie stężonego roztworu wyciąga wodę z komórek. Usunięcie go może spowodować zbyt szybkie ponowne napływanie wody.
Nowoczesne protokoły stosują rampy stężenia, roztwory nośnikowe, kontrolę temperatury i substancje nienasiarczające, aby utrzymać wahania objętości w granicach tolerancji.
3. Nierównomierne dostarczanie
Narząd nie jest pojemnikiem z jednorodnym płynem. Krioprotektant przemieszcza się przez naczynia, przenika przez ściany naczyń włosowatych i dyfunduje przez tkankę.
Skrzepy, obrzęki, choroby naczyniowe, niedokrwienie oraz bariera krew-mózg mogą pozostawić niektóre obszary poniżej stężenia wymaganego do zahamowania lodu.
Dlatego współczesneperfuzje mierzą ciśnienie, przepływ, temperaturę oraz stężenie żylne zamiast polegać wyłącznie na objętości roztworu.
4. Gradienty termiczne
Duży obiekt ochładza się od zewnątrz do wewnątrz. Różne temperatury powodują różne tempo kurczenia się.
W pobliżu i poniżej temperatury zeszklenia materiał nie może szybko rozładować naprężeń. Jeśli naprężenie przekroczy jego wytrzymałość mechaniczną, mogą powstać pęknięcia.
Roztwór poddano chłodzeniu z kontrolowaną szybkością, wyżarzaniu w pobliżu Tg oraz wolniejszemu schodzeniu przez obszar szklisty. Te zasady kształtują obecniekomputerowo sterowane schładzanie ludzkiego ciała.
1990 i 2000: mieszaniny zastępują myślenie o pojedynczych środkach
Żaden krioprotektant nie spełniał optymalnie wszystkich wymagań. Badacze coraz częściej łączą środki penetrujące, aby każdy mógł wnieść swój wkład bez osiągania najgorszego indywidualnego stężenia.
Roztwory nośnikowe kontrolowały jony, pH oraz warunki osmotyczne. Niewnikające polimery wpływały na zachowanie wody w tkance oraz funkcjonowanie naczyń krwionośnych.
Syntetyczne blokery lodu celowały w heterogeniczną nukleację i wzrost lodu. Zmniejszyły zależność wyłącznie od brutalnego stężenia krioprotektantu.
Roztwory takie jak VS55, a później M22, stanowiły inżynierię systemową: wiele środków, blokery lodu oraz starannie zaprojektowaną chemię nośników połączono z określonymi protokołami perfuzji i termicznymi.
Przegląd2004 dotyczący witryfikacji narządów opisuje postępy w redukcji toksyczności, uszkodzeń chłodniczych, kontroli nukleacji oraz perfuzji narządów.
Istotnym postępem nie było zniknięcie toksyczności. Badacze nauczyli się rozkładać obciążenie pomiędzy chemię, czas i temperaturę.
Eksperymenty na nerkach królika: ważne i łatwe do przecenienia
Praca nad nerką królika wykazała, że unaczyniony narząd ssaka można wypełnić złożonym roztworem witryfikacyjnym, schłodzić do stanu szklistego, ogrzać ponownie i przeszczepić.
Zgłoszono, że jedna z nerek podtrzymywała funkcjonowanie królika jako jego jedyny działający narząd przez wydłużony okres.
Ten wynik ma znaczenie, ponieważ przekroczył granicę od mikroskopijnych próbek do funkcji narządu. Nie ustanowił jednak wiarygodnej procedury klinicznej.
Późniejsza literatura wskazuje, że długoterminowy sukces przeszczepu nie został wiarygodnie osiągnięty. Dystrybucja, toksyczność i konwencjonalne ogrzewanie powierzchniowe pozostawały czynnikami ograniczającymi.
Poniższy status epistemiczny jest właściwy: znaczący dowód koncepcji z problemem powtarzalności i skali.
2015: jakość konserwacji staje się widoczna w skali synaptycznej
Krioprezerwacja stabilizowana aldehydami połączyła chemiczne utrwalenie, perfuzję krioprotektantem i witryfikację w mózgach królika i świni.
Badanie2015 zgłosiło wyraźne błony, synapsy, pęcherzyki, osłonki mielinowe i struktury wewnątrzkomórkowe po ponownym ogrzaniu i przygotowaniu do mikroskopii elektronowej.
Udowodniono, że doskonała ultrastruktura nerwowa może przetrwać cykl przechowywania bez lodu w dużych mózgach.
Nie wykazano jednak żywotnego powrotu do zdrowia. Utrwalenie aldehydami celowo tworzy poprzeczne wiązania w materiale biologicznym i jest niezgodne z normalnym przywróceniem funkcji życiowych.
Eksperyment odpowiedział zatem na pytanie strukturalne, a nie na pytanie o pełne ożywienie.
Szerzej rzecz ujmując, jego wkład był metodologiczny: konserwację należy oceniać przez badanie struktur istotnych, a nie jedynie przez obserwację, że próbka wygląda na szklistą.
2023: nanogrzanie rozwiązuje problem ogrzewania w nerkach szczura
Schłodzenie jest tylko połową odwracalnej krioprezerwacji. Ogrzewanie ponownie jest często trudniejsze.
Jeśli ogrzewanie jest zbyt wolne, lód może narastać podczas dewitryfikacji. Jeśli ciepło dociera głównie z powierzchni, gradienty termiczne mogą spowodować pęknięcia narządu.
Nanogrzanie rozwiązuje oba problemy poprzez rozprowadzenie nanocząstek tlenku żelaza w układzie naczyniowym i ogrzewanie ich za pomocą przemiennego pola magnetycznego o częstotliwości radiowej.
W badaniu 2023 naukowcywitryfikowali nerki szczura, przechowywali je do 100 dni, nanogrzali je i przeszczepili.
Nerkomórki odzyskane przywróciły funkcję nerek niezbędną do utrzymania życia u biorców bez własnych nerek w okresie obserwacji.
Osiągnięcie to było możliwe dzięki więcej niż tylko ogrzaniu. Zespół zastosował mniej toksyczną formulację i modelował obciążenie krioochronne w celu poprawy stężenia tkankowego.
To powtarzająca się lekcja z historii witryfikacji: rozwiązanie jednego wąskiego gardła ujawnia kolejne, a skuteczne odzyskanie wymaga sprawnego funkcjonowania całego łańcucha.
2024 do 2026: większe systemy fizyczne i funkcjonalna tkanka nerwowa
W 2024 badacze donosili owitryfikacji fizycznej w skali ludzkiego narząduw systemach o objętości od 0.5 do 3 litrów.
Zastosowali oni wewnętrzną termometrię, wyżarzanie, kontrolowane chłodzenie oraz badanie mikro-CT. Wykazali również nanonagrzewanie w objętościach do 2 litrów.
Największe demonstracje miały głównie charakter fizyczny. Unikanie widocznego lodu i pęknięć jest konieczne, lecz nie dowodzi biologicznego odzyskania narządu wielkości ludzkiego organu.
W 2026 badanie opublikowane w czasopiśmiePNASdonosiło o krótkoterminowym funkcjonalnym odzyskaniu tkanki hipokampa dorosłych myszy po witryfikacji i ponownym ogrzaniu.
Badanie mierzyło morfologię, reaktywność mitochondriów, pobudliwość neuronów, transmisję synaptyczną oraz długotrwałe wzmocnienie.
Obejmowało ono tkanki mózgowe myszy oraz niskoefektywne preparaty całego mózgu, nie zaś ludzki mózg. Jego znaczenie jest węższe, lecz nadal istotne.
Udowodniło ono, że tkanka nerwowa dorosłych ssaków może odzyskać funkcje elektrofizjologiczne po zatrzymaniu ruchliwości molekularnej w stanie szklistym.
Ludzka biostaza dziedziczy naukę w trudniejszych warunkach
Eksperymenty z przechowywaniem narządów rozpoczynają się od zdrowej tkanki, kontrolowanego czasu oraz planowanego dostępu do układu naczyniowego.
Ludzka biostaza rozpoczyna się po śmierci prawnej. Choroba, ciepłe niedokrwienie, zakrzepy, obrzęki, transport oraz choroby naczyniowe mogą wszystkie osłabiać dostarczanie krioochronne.
Bezpośrednim celem jest zachowanie struktury w celu ewentualnej przyszłej naprawy, nie zaś obecnie odwracalnego przeszczepu.
To właśnie ta różnica sprawia, że laboratoryjne twierdzenia nie mogą być bezpośrednio przenoszone na twierdzenia dotyczące pacjentów.
Jak firma Tomorrow.bio dostosowała witryfikację do warunków terenowych
Firma Tomorrow.bio wprowadziła perfuzję krioprotekcyjną całego ciała do wyspecjalizowanych ambulansów. Procedura może zostać rozpoczęta w pobliżu pacjenta, zamiast czekać na transport do Szwajcarii.
To zmienia istotny czynnik, którego chemia nie jest w stanie naprawić: ilość niedokrwienia przed perfuzją.
Obecny protokół wykorzystuje chemię roztworu opartego na VM-1, dostosowaną do krioprotekcji w terenie oraz późniejszego transportu suchym lodem.
Program badawczyEuropean Biostasis Foundation przetestował VM-1 w symulowanych warunkach poumiercych, w tym przy trzech godzinach ciepłego niedokrwienia.
Program mierzył współczynnik załamania światła w żyłach, czas perfuzji, zmianę masy, kurczenie się mózgu oraz tworzenie się lodu, testując jednocześnie zmiany w płynie perfuzyjnym i procedurze.
To jest praktyczny front badań nad przypadkami ludzkimi: nie chodzi o to, czy idealne rozwiązanie może przeprowadzić witryfikację, ale o to, jak dobrze można perfundować rzeczywistego pacjenta z niedokrwieniem.
Pomiar stał się częścią procedury
Wczesne badania nad witryfikacją często określały sukces poprzez przezroczystość, kalorymetrię, dyfrakcję rentgenowską, przeżycie lub funkcję po ponownym ogrzaniu.
Obecnie biostazę ludzką nie można oceniać na podstawie powrotu do zdrowia jako punktu końcowego. Potrzebuje zatem niedestrukcyjnych i próbkowanych metod pomiaru jakości zachowania.
Firma Tomorrow.bio wykonuje tomografię komputerową każdego pacjenta w tej samej temperaturze ciekłego azotu, aby oszacować rozkład krioprotektantu oraz zidentyfikować lód lub makroskopijne defekty w standaryzowanych warunkach.
Za oddzielną zgodą, mikropobrania nerwowe mogą wspierać ocenę mikroskopii elektronowej błon, synaps i lokalnej ultrastruktury.
Metody te oraz ich ograniczenia zostały opisane wprocedurach kontroli jakości biostazy.
Pomiar zmienia sam proces rozwoju. Gdy niepowodzenie staje się widoczne i porównywalne między przypadkami, zmiany w chemii i protokole mogą być ukierunkowane na jego rozwiązanie.
Co uległo poprawie, a co pozostaje nierozwiązane
Współczesna witryfikacja osiągnęła kilka rzeczy, których wczesne zamrażanie nie mogło:
- Bezlodowe przechowywanie wielu komórek, zarodków i małych tkanek.
- Funkcjonalne odzyskanie witryfikowanych narządów zwierzęcych w określonych eksperymentach.
- Ochrona strukturalna na poziomie synaptycznym w utrwalonych mózgach ssaków.
- Komputerowo sterowane chłodzenie i wyżarzanie większych systemów.
- Objętościowe podgrzewanie za pomocą technologii takich jak nanogrzanie.
- Metody tomografii komputerowej i mikroskopii elektronowej do pomiaru rzeczywistych wyników ochrony.
Nie doprowadziła jednak do odwracalnego ludzkiego całościowego krioprezerwowania ciała.
Pozostałe problemy obejmują: niedokrwienie pośmiertne, nierównomierną perfuzję, toksyczność krioprotektantów, wpływ na barierę krew-mózg, gradienty termiczne w całym ciele, unikanie pęknięć oraz bezpieczne i równomierne podgrzewanie.
Nawet udana ochrona strukturalna pozostawiłaby w przyszłości problemy związane z naprawą, przywróceniem do życia i leczeniem pierwotnej przyczyny śmierci.
Te rozróżnienia zostały opracowane wwyzwaniach technicznych dotyczących odwracalnego krioprezerwowania.
TL;DR: Witryfikacja została udoskonalona dzięki lepszym krioprotektantom, perfuzji, kontroli lodu, chłodzeniu, podgrzewaniu i pomiarowi struktury. Niektóre problemy zostały rozwiązane w małych skalach, podczas gdy odwracalność całego ciała człowieka pozostaje nierozwiązana.
Narzędzie praktyczne w szczegółach
Interaktywne narzędzie pomaga zbadać pytanie poruszone w tym artykule.
Ładowanie interaktywnego narzędzia...
Dalsza lektura