Po perfuzji krioprotekcyjnej pacjent nie jest po prostu umieszczany w ciekłym azocie.
Pacjent podlega komputerowo sterowanemu programowi schładzania trwającemu kilka dni. Czujniki umieszczone wewnątrz pacjenta wskazują, czy różne regiony anatomiczne schładzają się równomiernie, czy też dochodzi do niebezpiecznych gradientów termicznych.
Problem inżynieryjny zmienia się podczas schładzania. Wczesne schładzanie powinno ograniczać tworzenie się lodu. W okolicach i poniżej temperatury zeszklenia precyzja oraz jednorodność termiczna stają się ważniejsze niż szybkość.
Dlaczego konieczne jest kontrolowane schładzanie
Środki krioprotekcyjne obniżają wymaganą szybkość schładzania, aby uniknąć tworzenia się lodu. Pozwalają one tkankom bogatym w wodę przejść w stan wysoko lepki, szklisty, zamiast ulegać rozległej krystalizacji.
Istotna temperatura zeszklenia, oznaczana jako Tg, zależy od roztworu, jego stężenia oraz metody pomiaru. Jest to zakres, a nie jeden uniwersalny próg biologiczny.
Dla roztworów istotnych w krioprezerwacji ludzkiej region ten znajduje się zwykle w okolicach -120°C do -135°C.
Powyżej tego zakresu zbyt wolne schładzanie może prowadzić do nukleacji i wzrostu kryształów lodu. Poniżej niego materiał zachowuje się coraz bardziej jak kruche ciało stałe.
Jeśli powierzchnia schładza się znacznie szybciej niż centrum, różne regiony kurczą się w różnym stopniu. Powstające naprężenia termomechaniczne mogą prowadzić do pęknięć.
Stwarza to ograniczoną ścieżkę postępowania: schładzać wystarczająco szybko przed zeszkleniem, a następnie kontrolować gradienty i szybkość schładzania, gdy pacjent staje się szklisty.
Zobaczróżnicę między zamrażaniem a witryfikacją w celu zrozumienia podstawowego zachowania fazowego.
Pierwsza generacja komory chłodzącej
Pierwsza generacja systemu firmy Tomorrow.bio, zwana skrzynią chłodzącą V1, ustanowiła podstawową architekturę kontrolowanego schładzania całego ciała.
Pacjent jest umieszczany wewnątrz dedykowanej izolowanej komory. Komputer steruje kriogenicznym środowiskiem komory, podczas gdy termopary mierzą temperatury w wielu lokalizacjach.
Sterownik realizuje zaprogramowaną krzywą, zamiast stosować maksymalne schładzanie w sposób ciągły. Każdy kanał czujnika jest rejestrowany jako część historii termicznej pacjenta.
Jest to już zasadniczo odmienne od bezpośredniego zanurzenia. Maszyna może spowalniać, utrzymywać lub modyfikować warunki komory w odpowiedzi na rzeczywiste zachowanie pacjenta.
Druga generacja systemu opartego na dewarze
Drugi projekt generacyjny firmy Tomorrow.bio przenosi kontrolowane schładzanie do specjalnie zaprojektowanego dewara.
Pacjent pozostaje wewnątrz dewara, podczas gdy specjalistyczna pokrywa integruje sprzęt do schładzania, komputerowe sterowanie, zawory, połączenia czujników oraz przepusty termopar.
Termopary są umieszczone w kilku miejscach wewnątrz pacjenta. Dodatkowe czujniki monitorują środowisko termiczne wewnątrz dewara.
System zatem rejestruje więcej niż zadaną wartość punktu nastawczego. Obserwuje, jak szybko różne mierzone obszary pacjenta reagują na schładzanie.
Komputer reguluje gradient temperatury dewara oraz tempo schładzania, aby utrzymać odczyty w dopuszczalnym zakresie określonym przez protokół.
Duże ciało nie może być doskonale izotermiczne podczas schładzania. Praktycznym celem jest zminimalizowanie rozbieżności i zapobieganie sytuacji, w której którykolwiek mierzony obszar wyprzedza lub opóźnia się w niebezpiecznym stopniu.
Geometria dewara redukuje również konieczność manipulacji pomiędzy kontrolowanym schładzaniem a kriogenicznym przechowywaniem. Ta sama zamknięta forma może zapewnić stabilne, symetryczne środowisko wokół pacjenta.
Temperatura punktu nastawczego nie jest temperaturą pacjenta
Regulator może szybko schłodzić środowisko. Nie jest w stanie natychmiast doprowadzić temperatury środka ludzkiego ciała do tej wartości.
Ciepło musi przemieszczać się z głębszych tkanek w kierunku powierzchni. Geometria, skład ciała, dystrybucja krioprotektantu oraz pozycja czujników wpływają na obserwowane opóźnienie.
Dlatego też jeden czujnik komorowy jest niewystarczający. Środowisko nominalne -130°C nie dowodzi, że każda mierzona część pacjenta osiągnęła -130°C.
System sterowania musi uwzględniać zarówno temperaturę bezwzględną, jak i różnice między kanałami. Najwolniejszy punkt, najszybszy punkt oraz ogólny zakres rozbieżności niosą ze sobą istotne informacje.
Kalibracja, umiejscowienie i ciągłość termopar również mają znaczenie. Niewiarygodne odczyty lub awarie czujników powinny być sygnalizowane, zamiast być cicho uśredniane w krzywej.
Trójstopniowy program temperatury firmy Tomorrow.bio
Obecny protokół składa się z trzech odrębnych faz. Wartości te są celami operacyjnymi dla tego sprzętu i podejścia krioprotekcyjnego, a nie uniwersalnymi stałymi dla każdego systemu witryfikacji.
1. Szybkie schłodzenie w kierunku -130°C
Pierwsza faza przenosi pacjenta od temperatury suchego lodu w kierunku około -130°C, tak szybko, jak bezpiecznie na to pozwala mierzony zakres temperatur.
Szybkość ma tutaj znaczenie, ponieważ niechronione obszary mogą nadal tworzyć lód, zanim tkanka stanie się szklista.
Komputer nie kieruje się jedynie upływem czasu. Monitoruje termopary i dostosowuje środowisko chłodzące wokół pacjenta.
2. Pozwolenie na kontrolowane odbicie w kierunku -120°C
Po osiągnięciu temperatury około -130°C chłodzenie aktywne jest redukowane, a pacjentowi pozwala się na naturalne ogrzewanie się do temperatury około -120°C.
Jest to faza wyżarzania. W pobliżu Tg materiał zabezpieczony krioprotektantem zachowuje wystarczającą mobilność molekularną, aby część nagromadzonych naprężeń mechanicznych mogła się rozładować.
Odskok temperatury zapewnia również czas na zbliżenie się cieplejszych i chłodniejszych obszarów do siebie, zanim materiał zostanie wprowadzony w sztywny, szklisty stan.
Wyżarzanie nie odwraca istniejącego uszkodzenia biologicznego. Jego cel jest węższy: redukcja gradientów termicznych oraz naprężeń powstałych na skutek nierównomiernego skurczu.
3. Zejście do -196°C w tempie około 1°C na godzinę
Od około -120°C docelowe tempo zejścia wynosi około 1°C na godzinę, aż pacjent osiągnie temperaturę ciekłego azotu.
Ostatni 76-stopniowy przedział zajmuje około trzech dni, nawet jeśli nie uwzględni się postojów i regulacji kontroli.
Utrzymanie tempa 1°C na godzinę w dużym, termicznie niejednorodnym ciele stanowi problem sterowania, a nie jedynie ustawienie zegara.
Regulator musi nieustannie dostosowywać środowisko w dewarze, aby termopary wewnętrzne opadały równocześnie, bez tworzenia nadmiernych gradientów.
Gdy jeden obszar opóźnia się, wymuszenie chłodniejszego środowiska może doprowadzić do nadmiernego ochłodzenia innego obszaru. Precyzja oznacza równoważenie całego pola czujników, a nie ściganie się z pojedynczym odczytem.
Dlaczego faza wyżarzania jest naukowo uzasadniona
Badania nad dużoobszarową witryfikacją identyfikują dwa konkurencyjne obszary awarii: niewystarczające chłodzenie powyżej Tg oraz nadmierne naprężenia mechaniczne wokół i poniżej Tg.
Badanie2024 human-organ-scale vitrification study wykorzystujące wiele wewnętrznych sond wykazało, że wyżarzanie redukuje gradienty przed wprowadzeniem materiału w fazę szklistą.
To samo badanie stwierdziło, że powolne chłodzenie poniżej obszaru wyżarzania pomaga uniknąć odbudowy dużych gradientów i naprężeń.
Oddzielne badaniathermomechanical research wykazały, że wyżarzanie w pobliżu Tg znacząco zmienia pozostałe naprężenia i osłabia ich zależność od poprzedniego tempa chłodzenia.
Badania te wspierają podstawową strategię kontroli. Nie stanowią one jednak niezależnego potwierdzenia każdego dokładnego punktu nastawczego w protokole całego ciała firmy Tomorrow.bio.
Całe ludzkie ciała są większe i bardziej heterogeniczne niż laboratoryjne roztwory lub narządy. Konieczne pozostają bezpośrednie zapisy temperatury oraz obrazowanie po schłodzeniu.
To, co rejestruje komputer
Użytecznym wynikiem nie jest komunikat stwierdzający „schłodzenie zakończone”. Jest nim kompletna seria czasowa ze wszystkich kanałów temperatury.
Zapis powinien przedstawiać prędkości, utrzymania, odbicia, gradienty między czujnikami, działania regulatora, alarmy oraz wszelkie odstępstwa od planowanej krzywej.
Te dane stają się częściąoceny jakości krioprezerwacji.
Po schłodzeniu, standardowe badanie CT w temperaturze ciekłego azotu może wykryć rozmieszczenie krioprotektantu, lód, znaczne deformacje i pęknięcia, których same dane temperaturowe ujawnić nie mogą.
Dlaczego zatrzymać się w temperaturze ciekłego azotu
W normalnym ciśnieniu atmosferycznym azot wrze w okolicach 77.34 kelwinów, co odpowiada około -195.8°C, zgodnie zNIST Chemistry WebBook.
Przechowywanie w ciekłym azocie jest pasywne. Dopóki w naczyniu znajduje się wystarczająca ilość cieczy, jej równowaga wrzenia utrzymuje stabilne środowisko kriogeniczne bez konieczności stosowania mechanicznego chłodzenia.
Kontrolowany spadek temperatury kończy się dopiero wówczas, gdy pacjent jest termicznie gotowy do tego stabilnego stanu. Przechowywanie nie jest stosowane jako substytut schładzania.
Projektowanie i kompromisy kolejnego etapu omówione są wwspółczesnych termosach kriogenicznych i przechowywaniu w temperaturze pośredniej.
TL;DR: Firma Tomorrow.bio stosuje komputerowo sterowane schładzanie oraz wewnętrzne czujniki temperatury. Proces schładza szybko w okolicach formowania szkła, redukując naprężenia termiczne, a następnie powoli opada w kierunku -196°C.
Narzędzie praktyczne w szczegółach
Interaktywne narzędzie pomaga zbadać pytanie poruszone w tym artykule.
Ładowanie interaktywnego narzędzia...
Dalsza lektura